【一探究竟】HPLC干扰峰来自哪儿？？ -

【一探究竟】HPLC干扰峰来自哪儿？？

展源 0 2025-04-09

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【一探究竟】HPLC干扰峰来自哪儿？？

高效液相色谱法中的干扰峰是广大色谱工作者甚为头疼的事情，本文通过对干扰峰的来源进行分类，对其产生原因进行分析探究，供广大同仁参考，便于后期快速解决同类问题。

对于液相色谱法中的干扰峰，笔者简单归纳为3类：试剂/溶剂、器材以及液相系统。下面笔者对每一类干扰峰来源做简单的分析。

1 试剂/溶剂

高效液相色谱法中，常用的试剂主要是有机溶剂、各种盐类及水。 有机溶剂一般多为购买的色谱级，所以出现问题的几率较小。但是分装出的有机溶剂，由于多次使用，被污染的概率较大，因此引入干扰峰的几率较高。其次是水，水中的杂质是干扰峰的主要来源之一，这是大家极易忽视的问题。采集波长较低的检测方法，建议使用高品质水，这样可以避免很多因为水质带来的问题。再次是各种盐类，这也是色谱干扰峰的主要来源之一。如图2所示，与图1相比，如图2加入磷酸二氢钾后，16.5min处出现干扰峰。对于无机盐引入的干扰峰，在方法开发初期一般就会给眼关注，寻找解决方案。方法确定后，盐的品种及级别也同时确定，因此盐对方法的影响基本可控。

水和无机盐引起的干扰峰，比较快捷的解决方案是安装鬼峰补集柱，这样可以有效的避免此类干扰。如果使用离子对试剂，则需选择不影响离子对试剂的鬼峰补集柱。

2 器材

干扰峰来源的第二个方面是流动相配制及样品前处理过程中接触的各种器材。

首先是流动相配制过程中接触的器材，包括烧杯、玻璃棒、pH计、滤杯、滤膜、流动相瓶等。 烧杯、玻璃棒是配制流动相首先接触的器材，因此建议配制流动相的烧杯、玻璃棒专用。滤杯实验人员只要清洗干净一般不会带来污染。需要注意的是，如果过滤含有离子对的流动相，建议增加清洗次数，避免清洗不干净污染后续流动相。因此，对滤杯的清洗应该建立基本的洗涤规程，保证实验人员对使用的器材清洗到位。滤膜也是干扰峰引入源头之一。如图3所示，乙腈经过有机系滤膜过滤后，在梯度洗脱中会引入较大干扰峰。鉴于色谱级试剂厂家已经过膜，且多数仪器都有脱气机，所以笔者建议无需再对甲醇、乙腈等纯有机相过滤。流动相瓶引入干扰峰的现象主要出现在夏季，这是由于夏季温度高，纯水相容易滋生细菌。后续的流动相瓶使用人员清洗不到位，所以导致引入干扰峰。因此流动相瓶的清洗要建立严格的洗涤规程。

再次样品前处理过程中接触的器材。 前处理过程中接触的器材主要包括容量瓶、滤头、注射器及进样瓶。容量瓶的清洗同流动相瓶、过滤装置一样，要建立良好的清洗规程。移液器材以及滤头、注射器，多为塑料制品，其化学惰性较玻璃制品差，因此容易引入干扰峰。如下图4、图5、图6所示案例，此方法检测波长为210纳米，溶剂为正己烷-异丙醇（90:10），溶剂分别接触移液枪枪头、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干扰峰。

进样小瓶若为一次性使用，一般不会引入干扰峰。如果进样瓶反复清洗，多次使用，则应建立清洗规程并对其清洗干净程度进行确认。

3 液相系统

与前两类干扰峰相比，液相系统干扰峰的解决更加困难。液相系统是一个动态过程，所以此类问题解决过程耗费时间长，而且要求实验人员有很高的色谱素养。笔者对此类问题来源主要归结为三类：强保留物质、离子对污染和管路滋生细菌。

首先是强保留物质的干扰，其主要特征是宽峰。 此类问题多数发生在等度洗脱中，梯度洗脱主要出现在高比例有机相处。这是由于强保留物质在当次进样中未洗脱出，在后续进样洗脱出来所致。如图7中9分钟处的色谱峰。

对于此类干扰峰，可通过延长采集时间或增加洗脱强度来消除对后续样品的干扰。至于如何延长采集时间，读者可通过下面的公式计算得到。

N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）

由公式（1）推导可知

tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）

其中，N-塔板数，在等度洗脱中N对所有峰相同；tR-保留时间；Wb/2-色谱峰半峰宽。

由公式（2）推知， tR2= tR1* W2b/2/W1b/2。积分结果显示，图7中，7min处的色谱峰W1b/2=0.12min，9min处的宽峰W1b/2=0.32min，由此可推知，图7中9min处的宽峰保留时间tR2= 7* 0.32/ 0.12=18.6min。图8为延长采集时间的图谱，20min处即为图7中9min处的色谱峰，与公式推导结果基本接近。延长采集时间后，后续图谱干扰峰消失。尽管按照此公式计算会有一定误差，但这足以让色谱工作者对其进行预判，设置合理的采集时间。

系统干扰峰第二个方面是离子对、螯合剂这种难以洗脱的试剂对液相系统的污染。 此类污染物多半是由于使用完毕含有离子对、螯合剂之类的流动相后，对系统的冲洗不彻底所致。此类污染物主要对一些采集波长较低的方法产生干扰，普遍表现是基线噪音大或者干扰峰，但随着方法的运行会逐渐趋于正常。系统干扰峰第三个方面是系统滋生细菌。对于系统滋生细菌，多数读者可能觉得不可思议，因为液相系统使用完毕都会用有机相冲洗保存。目前很多方法流动相A都是水相，虽然水相每日都会新配制，但如果由滤头到比例阀这一段管路长时间在水相中就会滋生细菌。随着时间的运行，梯度洗脱中会逐渐的产生干扰峰。此类问题虽然比较隐蔽，但比较容易解决，只要每日对放置纯水相的通道用有机相冲洗即可避免此类问题。

以上便是笔者对干扰峰来源的简单分析。然而对于干扰峰的产生，要具体问题具体分析，因为其还与具体色谱条件有关。同一种试剂，在方法A中产生干扰，但在方法B中可能完全没有干扰。因为采集波长，有机相初始比例及最终比例等因素，都可能会对干扰峰的出现产生影响。

实际工作中，色谱工作者遇到的最大困难是如何识别判断干扰峰属于哪一类。由于找不清问题根源，所以也就难以有针对性的解决问题。笔者简单分享一下个人解决干扰峰的经验：

首先，判断干扰峰是来自系统还是供试品。 此时需要运行两次采集：只运行梯度与正常进样。如果只运行梯度，未进样品，依然有干扰峰，这种情况下多半是系统所致，此时解决方向应针对液相体系，而不是针对供试品。鉴于有些型号的仪器，如果不进样，不会执行进样动作。因此，对于此类仪器，建议执行正常进样与减少进样量两次采集，根据干扰峰的大小来判断是系统原因还是供试品原因。

其次，调查仪器使用记录，与实验人员交流。 笔者一般会查看仪器使用记录，了解近期运行哪些方法以及这些方法的流动相组成。查看完相关记录后，再跟实验人员交流，了解其操作过程。比如，对于A通道滋生细菌问题，笔者通过仪器使用记录发现，出现干扰峰的仪器近一周都是在运行同一个方法。实验记录显示，此方法的流动相为0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系统滋生细菌所致。但实验人员告知，每天晚上都会用有机相冲洗，不可能滋生细菌。再次询问得知，实验人员每晚的冲洗是切换成C通道执行，而A通道却一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切换通道冲洗系统这种不规范操应尽量避免。

第三，采取单因素试验解决问题。每次只改变一个因素，逐步找到干扰峰的来源。 此类做法看似比较费时费力，但却让色谱工作者对各类色谱问题产生原因有理性认知，增强了色谱工作者解决问题能力，有助于后期问题的解决排查。

最后，对单因素排查出的解决方案进行验证，将问题重现。 如果根据单因素变量找到的解决方案无法将问题重现，很有可能排查出的影响因素并不是问题真正的根源，需继续排查。能够重现问题，问题才算解决，方可将其关闭，不再研究。

以上便是笔者在解决高效液相色谱法干扰峰时一些个人经验，期望能够给广大色谱工作者带来一些帮助。文中如有不当之处，请各位同仁批评指正。

参考文献：

《实用高效液相色谱法的建立》
《现代液相色谱技术导论》
《Some EssentialPrinciples of Effective Troubleshooting》
《Rules of Thumb forReversed‑Phase LC: What’s In Your Chromatographic Mind?》
《Letting theChromatograph Talk, Part I: Looking for Troubleshooting Clues in UnexpectedPlaces》
《What LCTroubleshooting Has Taught Me》

文章来源：分析与GMP

责任编辑：展源

审核人：何发

内容来源：分析与GMP

责任编辑：展源

审　　核：何发

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