东北农业大学文理学院的徐雅琴、杨昱﹡等
采用微波辅助
HNO
3
-Na
2
SeO
3
法对蓝靛果果实多糖进行硒化修饰，并研究其理化性质、结构特征以及对红细胞氧化保护能力。该研究可为蓝靛果果实多糖的进一步开发利用提供理论依据。
经
Sephadex G-200
凝胶柱纯化后得到
PSLP
，洗脱曲线如图
1A
所示，仅有一个单一较对称的峰，说明纯化后得到的硒多糖组分比较均一。
PSLP
成分测定结果表明：多糖质量分数（
89.96±1.60）%
、硒含量（
0.184±0.03
）
mg/g
、还原糖质量分数
（0.32±0.02）%
、糖醛酸质量分数
（35.06±1.48）%
、蛋白质质量分数
（0.02±0.002）%
、多酚质量分数
（0.03±0.004）%
。按照同样方法测定的原多糖
PLP
成分结果：多糖质量分数
（83.18±1.44）%
、还原糖质量分数（
0.22±0.15）%
、糖醛酸质量分数
（32.82±0.47）%
、蛋白质质量分数
（0.02±0.003）%
、多酚质量分数（
0.03±0.005）%
。可见，
PSLP
和
PLP
中多糖和糖醛酸含量接近，而蛋白、多酚等杂质基本除去。
如图1B所示，多糖的高效液相色谱图只得到一个峰，进一步说明PSLP
含量较高且组分均一。根据
GPC软件拟合的标准曲线方程为
lgmw＝14.364-0.6951t
（
R2
＝0.9938），保留时间为9.487 min时，计算得到
PSLP
的重均分子质量为58828.3 kDa
。根据单糖标准品和
PSLP
的保留时间和峰面积（图
1C
），可知
PSLP是由6种单糖组成的酸性杂多糖，单糖组成及物质的量比为半乳糖醛酸∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1∶3.06∶6.18∶0.29∶1.78∶13.01。
如图2A所示，PSLP在4000～500 cm
-1
波数范围内均具有多糖的特征吸收峰。3406.91cm-1处和2929.19 cm-1处的吸收峰归因于O—H和C—H伸缩振动。1736.04 cm-1和1615.45 cm-1处出现的吸收峰归因于羧基或者酯基中羰基的伸缩振动。此外，1423.49 cm-1处有吸收峰证明多糖中含有糖醛酸。1100～1000 cm-1范围内的吸收峰说明存在吡喃糖。895.39 cm-1处的吸收峰说明存在β型糖苷键。919.09 cm-1处吸收峰代表有C—O—Se的存在，初步证明蓝靛果多糖硒化修饰成功。
PSLP的
1
H-NMR和
13
C-NMR谱图如图2B所示，异头质子和异头碳在
δ（H）
4.0～5.3和δ（C）90.0～110.0处的化学位移表明两种多糖中均存在α-和β-构型单糖。PSLP的6种异头H1/C1化学位移为4.41/103.42、4.43/103.19、4.92/97.62、5.09/99.68、5.18/98.41、5.22/109.27，表明硒多糖含有
β-D-
半乳糖、
β-D-
甘露糖、
α-D-
葡萄糖、
α-D-
半乳糖醛酸、
α-L-
鼠李糖和
α-L-
阿拉伯糖6种糖残基。此外，PSLP的2D NMR谱图HSQC和COSY分析如图2C、D所示。以残基A为例，在
1
H-
1
H COSY
图中处检测到
δ（H/H）
的耦合峰化学位移为
4.41/3.49、3.49/3.85、3.85/3.98
、
3.98/3.62
、3.62/3.68，可知残基A的H2～H6的化学位移依次为δ（H）3.49、3.85、3.98、3.62、3.68。此外，根据
1
H-
13
C HSQC谱图可以得到δ（H/C）4.41/103.44、3.49/70.76、3.85/76.61、3.98/68.66、3.62/75.17和3.68/61.46的交叉峰，因此将δ（C）70.76、76.61、68.66、75.17和61.46归属于残基A的C2～C6的化学位移。由文献中残基化学位移的信息可推断残基A为→3)-β-D-半乳糖-(1→。采用以上方法对其余5个糖残基进行归属，推断出A～F糖残基分别为→3)-β-D-半乳糖-(1→、→4)-β-D-甘露糖-(1→、→6)-α-D-葡萄糖-(1→、→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→、→2,4)-α-L-
鼠李糖
-(1→
、
α-L-
阿拉伯糖
-(1→
。6 种糖残基的化学位移如表1所示。
由图3A可知，在无H2O2作用条件下，溶血率没有变化，即人体红细胞无损伤。添加H2O2溶液后，红细胞溶血率随着H2O2浓度和孵育时间增加而增加。孵育时间为3.0 h、H2O2浓度为150 mmol/L时，人体红细胞溶血率为（89.81±1.56）%，损伤明显。因此，本实验选取此条件作为后续实验中红细胞氧化损伤的条件。
如图3B所示，当不加H2O2只加10 mg/mL PSLP或VC时，红细胞溶血率与正常细胞相近，说明PSLP和VC对人体红细胞没有损伤作用。只加H2O2时，氧化损伤组红细胞溶血率为（92.82±0.41）%，说明H2O2对红细胞损伤作用较大。PSLP保护组红细胞溶血率随PSLP质量浓度增大而减小，呈剂量依赖性关系；质量浓度为10.0 mg/mL时，PSLP和VC保护组对红细胞保护作用最大，此时溶血率分别为（60.30±1.23）%、（43.74±0.76）%。即PSLP质量浓度为10.0 mg/mL时，溶血率降低了32.52%。
PSLP对H2O2诱导损伤的红细胞中MDA含量和ROS水平的影响
由图3C可知，PSLP或VC对照组基本不会使正常红细胞中MDA含量增加，说明PSLP或VC不会造成正常人体红细胞损伤。加入H2O2诱导损伤后，红细胞中MDA含量从（19.88±0.39）nmol/mL升至（62.72±1.26）nmol/mL。加有不同质量浓度PSLP和VC保护的实验组中，红细胞中MDA含量均有一定程度减小，且与PSLP和VC质量浓度成剂量依赖性关系。质量浓度为10.0 mg/mL时，PSLP和VC参与保护后红细胞中MDA含量达到最小值，分别为（45.68±0.86）nmol/mL和（35.98±0.71）nmol/mL。即PSLP质量浓度为10.0 mg/mL时，MDA含量减少17.04 nmol/mL。
如图3D所示，H2O2氧化损伤组的红细胞内荧光强度是正常细胞对照组的19.30倍，说明H2O2能够明显使细胞内ROS过量累积。PSLP或VC保护组中，随着质量浓度增加，红细胞内ROS水平均发生显著下降（P＜0.05）。质量浓度为10 mg/mL时，PSLP和VC参与保护的红细胞内ROS水平比氧化损伤组分别降低了44.93%和76.81%。
由以上结果可知，PSLP能够有效地阻止ROS产生，抑制MDA形成，进而保护红细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。
PSLP对H2O2诱导损伤的红细胞中抗氧化酶活性的影响
如图4所示，H2O2处理后，未添加PSLP或VC组的红细胞内GSH-Px、CAT和SOD酶活力达到最高，说明红细胞损伤严重。添加PSLP或VC质量浓度至10 mg/mL时，红细胞内GSH-Px酶活力从（52.44±1.46）mU/mg分别降低到（32.37±1.10）、（19.29±0.45）mU/mg；CAT 酶活力从（22.69±1.00）U/mg 分别降低到（12.74±0.15）、（10.27±0.33）U/mg；SOD酶活力从（275.71±9.20）U/mg 分别降低到（111.78±4.57）、（78.92±2.47）U/mg。即PSLP质量浓度为10.0 mg/mL时，红细胞内3 种抗氧化酶（GSHPx、CAT、SOD）活性降低量分别为20.07 mU/mg和9.95、163.93 U/mg。
由以上结果可知，PSLP调节了CAT、GSH-Px和SOD的活性，随着PSLP质量浓度的增加，CAT、GSH-Px和SOD的活性逐渐接近正常红细胞的水平，使红细胞内抗氧化酶系保持在正常的生理范围，抑制脂质过氧化，维持红细胞内“氧化应激-抗氧化防御”系统的动态平衡。这可能是由于PSLP能够阻止H2O2进入红细胞，从而降低了对CAT、GSH-Px和SOD高活性的需求。
研究制备PSLP的硒含量为（0.184±0.03）mg/g，多糖质量分数为（89.96±1.60）%，重均分子质量为58828.3 kDa。PSLP含有6种单糖残基：→3)-β-D-半乳糖(1→、→4)-β-D-甘露糖-(1→、→6)-α-D-葡萄糖-(1→、→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→、→2,4)-α-L-鼠李糖-(1→、α-L-阿拉伯糖-(1→。PSLP对红细胞氧化损伤具有一定保护作用，PSLP质量浓度为10.0 mg/mL时，对红细胞氧化损伤的保护作用最强，红细胞溶血率、ROS以及MDA含量分别降低了32.52%、44.93%、17.04 nmol/mL。抗氧化酶（GSH-Px、CAT、SOD）活力随着PSLP剂量增加而降低，表明PSLP可以使红细胞恢复到接近正常状态，从而保护红细胞免受氧化损伤。因此硒化蓝靛果多糖具有作为良好应用前景的补硒剂和抗氧化剂的潜力。
本文《蓝靛果硒多糖的理化性质、结构表征及红细胞氧化损伤保护活性》来源于《食品科学》2023年44卷6期17-24页，作者：徐雅琴，邵春天，耿莹，郑秀雯，王茹娟，杨昱。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220710-098。
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