急性心肌梗死(AMI)是全球死亡的主要原因，通过治疗心血管疾病可以预防。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是AMI临床诊断的金标准，然而近二十年来，其标准化一直是一个全球性问题。同一样本的检测结果最大差异可达200倍，这种显著偏差是因为血液中cTnI形式的复杂性、患者内源性抗体的影响以及所选择的不同检测方式所带来的很多不确定性造成的。

此外，针对不同表位的抗体、以及多个抗体之间的相互作用给测量带来了很大的不确定性。因此，抗体及其靶结合位点的标准化对于cTnI试剂盒的标准化至关重要。有研究报告表明，HDX-MS(氢氘交换质谱)由于其使用小样本量、高灵敏度和高通量，而优于传统的表位映射技术。此类设备中的表位分析是在溶液中进行的，这使得各种环境条件，以最大限度地模拟分析物相互作用。HDX-MS以低成本提供快速结果，故适用于灵活和大规模的表位分析。特别是HDX-MS在多克隆抗体表位作图领域的应用，展示了该技术在复杂系统表位研究中的潜在价值。中国计量科学研究院的宋德伟和南京科技大学的周敏曾带领科研人员使用传统的HDX-MS工作流程研究了C反应蛋白免疫比浊法试剂盒中定量偏倚和表位差异之间的关系;近期，他们又使用类似的工作流程，针对不同的cTnI诊断测试，分析了针对 cTnI的抗体。

图1. 不同心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体的氢氘交换。(A)Ag的HDX差异总结：(Ag+Ab)(Ag=抗原;Ab=抗体;未识别的肽用白点标记，已识别的用特定颜色进行标记)。(B)本实验体系A(蓝色)、B(黄色)和C(红色)中，游离cTnI中肽的相对氘摄取以及cTnI与每种抗体的复合物。(C)每种抗体识别的cTnI。(D)cTnI抗体混合物复合物中感兴趣的肽的HDX差异。

作为参考，通道2通过胺偶联法与cTnI(40 g/mL)偶联。最终确定值为800 RU。使用不同检测试剂盒的抗体表位作图，将每种mAb和pAb与cTnI混合，并制备复合物。使用Waters HDX-MS平台(用于HDX的LEAP H/D-X PAL系统和用于样品消解、分离和测量的Waters ACQUITY M-Class与Waters SYNAPT G2质谱联用)。通过MSE模式进行质谱采集，并得到如下结果。

图2. A、B和C cTnI的比较。(A)定量结果图示。(B)一致性评估。其中实心黑线是偏差百分比平均值，红色和绿色虚线分别是药物决定水平和95%一致性限制中的允许偏差。

不同测试系统中抗体识别的表位区域中，cTnI是游离的，或与心肌肌钙蛋白T(cTnT)和肌钙蛋白C(TnC)结合为血液中的二元或三元复合物(cTnIC, cTnTIC)。首先，我们使用HDX-MS监测天然游离CTnI与不同抗体的相互作用，Ab或pAb的摩尔比是抗原的2.2倍。我们观察到游离cTnI的序列覆盖率为91.1%，而向cTnI添加抗体会改变序列覆盖率(图2)。尽管不同情况下监测的肽段数量不同，但pAb1与cTnI的结合将序列覆盖率降低到最低73.3%后，仍能覆盖cTnI的主要区域，满足表位作图实验的要求。

图3. 不同基体抗体的比较。(A)抗体的表面拟合曲线。最低和最高平衡离解常数(KD)用黑色虚线标记。(B)蛋白图示。(C)分析计算的游离cTnI(蓝色)、cTnTIC(粉红色)和二元复合物cTnIC(红色)的可及表面积(ASA)分数。

在这项研究中，科研人员开发了一种基于HDX-MS的IVD试剂抗体评估方法，用于评估各种抗体和抗体混合物的表位。测试了来自市售的A、B和C三个测试剂。对于试剂盒B中的多克隆抗体，观察到潜在的表位残基158-169，并结合进一步分析，我们得出结论：该区域不适合血清中cTnI的定量。由于该试剂盒使用免疫比浊法，因此没有与其他两个试剂盒进行更详细的比较。检查检测试剂盒A和C的表位区域，表明他们的差异源于抗体R195和D1;它们在cTnI的不同域被识别。因此，它们对血液中不同形式的cTnI的识别能力有所差异。同时，抗体表现出表位特异性，影响与待测抗原的结合能力和效率，导致定量结果存在偏差。各种抗体混合物的表征表明，多种抗体的共存导致某些结合位点的屏蔽，从而导致IVD试剂的定量能力下降。基于此，我们认为体外诊断试剂生产企业在设计试剂盒时必须考虑以下因素：(1)复杂的形态，(2)水解形式，(3)磷化形式，(4)氧化还原形式。

此外，我们选择了多种抗体组分与Tn的不同部分结合，以最大限度地检测其所有形式。并且，应注意由于设计表位的差异和多种抗体在混合物中的共存而导致的定量结巢的偏常。因此，选择定量较为简单的抗体进行测试对提高结果准确度会有明显帮助。通过对抗体及其表位区域的详细研究，可以提高cTnI诊断系统的一致性，这将促进cTnI诊断的标准化。

关于沃特世解决方案

在本研究中，Waters HDX-MS平台(Waters ACQUITY M-Class与Waters SYNAPT G2 质谱联用)发挥了重要作用。

图4. Waters SYNAPT G2 质谱。

Waters SYNAPT系列质谱是结合了StepWave和UPLC分离与定量飞行时间(QuanTof)技术的四极杆飞行时间质谱，能实现优异的峰容量和数据质量。与其他质谱分析器不同，QuanTof能够提供高质量数、高分辨率、精确质量数和准确的同位素比例、更宽的动态范围(谱图内和定量)和m/z范围，并且都可以在较快的采集速率实现，即便是对于高基质负荷的样品也是如此。

通用型UPLC/MSE采集技术可以记录每个可检测的分子或离子的碎片离子数据，与其它“数据独立型分析(DIA)”技术相比，具有良好的占空比;同时我们的信息学技术可以为各种各样的应用提供精简的数据分析流程。使用“非数据独立型”工作流程，即可获得更高效、更有效的靶向MS/MS;使用高分辨率MRM工作流程，可获得更低的定量限;而使用FastDDA，则可实现更高的MS/MS灵敏度，扩大研发实验中的化合物覆盖范围，从而给本实验提供了坚定的条件保障。