想要搞懂Hilic ，首先要明白Hilic的流动相和固定相。

1、流动相

在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。

水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。

2、固定相

应用于Hilic色谱的固定相有：纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。纯硅胶柱有固定相不易流失的优点，在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时，最受欢迎；氨基柱，在Hilic色谱中的应用，特别适合碳水化合物（糖类）分离；二醇基柱，亲水性很好，可以提供不同的选择性。

Hilic和正相色谱相比

1、固定相的区别

同样是Silica，NH2，Diol柱，与用于正相色谱中的 不同，专为Hilic色谱设计的 ，可以用于水/有机物的流动相中，换句话说，Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高，否则会因固定相的水解，出现基线噪音大、 寿命短等问题。所以用于正相色谱中的 ，不一定能用于Hilic色谱。而适用于Hilic色谱的 ，可以用于正相色谱中。

2、应用范围的差异

正相色谱主要用于极性大的脂溶性化合物，而Hilic色谱主要用于极性大的水溶性化合物。

3、总结

和正相色谱相比，用于Hilic色谱中的Silica/NH2/Diol等 耐水性更好，Athena NH2-RP在Hilic色谱糖类分析中表现优异。

对于极性强的化合物，如果在正己烷、异丙醇中溶解度较好，推荐用正相色谱，如果在水中溶解度较好，推荐用Hilic色谱。

Hilic和反相色谱相比

1、保留行为差异

和反相色谱相比，Hilic色谱对极性大的水溶性化合物保留能力更强。极性较强的尿素，在Athena C18-WP (LAEQ-462572)没有保留，而在Athena NH2-RP (LAEQ-462568)可以很好的保留。

2、流动相中水的洗脱强度

以Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）对糖类物质的分析为例。

流动相：乙腈/水（75：25）

色谱峰：1.果糖 2.葡萄糖 3.蔗糖 4.麦芽糖

应用：蜂蜜 中国药典2020年版一部 P374

流动相：乙腈/水（70：30）

色谱峰：1.蔗糖 2.乳糖

应用：乳糖 中国药典2020年版四部 P690

对比蜂蜜和乳糖应用，采用同一支Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568） ，流动相从乙腈/水（75：25）变为乙腈/水（70：30）后，蔗糖的出峰时间从14.008min缩短至8.840min，流动相中水相比例增加，目标化合物出峰变早。我们知道，反相色谱中，流动相中水相比例增加，目标化合物的出峰会变晚。在Hilic色谱中，流动相中的水相部分表现为强溶剂，这和传统的反相色谱完全相反。

3、总结

对于极性大的亲水性化合物，在反相色谱中很难保留，可以用Hilic色谱增加保留。

在反相色谱中，流动相中的水相部分表现为弱溶剂，而在Hilic色谱中，水表现为强溶剂。

表1 反相、正相、Hilic色谱对比

Hilic色谱作为正相和反相色谱的补充，采用极性的固定相和流动相，在分析极性强的水溶性化合物中有很大优势。

通常情况，流动相中水相比例为3%-40%，水相比例太高，一方面目标化合物保留太弱，另一方面加快键合相的水解。

固定相的耐水解性要求更高，如Athena NH2-RP在Hilic色谱中特别适合糖类物质的分析，基线噪音小， 寿命长。

HILIC 的使用注意事项

1、HILIC 的平衡

• 使用 50 倍柱体积的 50/50 的乙腈/水相缓冲溶液（缓冲液的最终浓度为 10mM）平衡新 。

• 在开始进样前，用 20 倍柱体积的起始流动相平衡 。

• 进行梯度分析时，进样间隔需要用 10 倍柱体积起始流动相平衡 ， 平衡不充分将导致保留时间漂移。

• 流动相中总是至少保持 5％的极性溶剂（如 5％水相缓冲液，5％甲醇或 3％甲醇+2%水相缓冲液等），保证 HILIC 硅胶填料始终被水浸润。
• 在流动相或梯度中至少保持有机溶剂（如乙腈）的比例不低于 40％。
• 不要使用磷酸盐缓冲溶液体系，因为磷酸盐缓冲液在 HILIC 色谱模式下会析出；使用磷酸则没有问题。
• 甲酸铵或乙酸铵水溶液缓冲系统比甲酸或乙酸的水溶液重现性更好。如果不能使用缓冲液而一定要使用流动相添加剂如甲酸，最好使用 0.2%的浓度而非 0.1%。
• 为得到最好的峰形，在流动相或梯度中总是保持缓冲系统的浓度为 10mM。
  
  

• 如果可能，尽量用 100％乙腈溶解样品进样。避免使用水配制样品溶液，请选择较弱的 HILIC 溶剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等配制样品溶液。
• 最常用的稀释剂为 75/25 乙腈/甲醇，这个体系充分平衡了样品的溶解度和峰形两个因素。
• 不要用水或 DMSO 做稀释剂，它们将导致峰形变得很差。
• 使用反相 SPE 技术将水或 DMSO 置换成乙腈再进样。如果不能这样操作，用有机溶剂稀释水或 DMSO。

• 开始时可以运行一个 95％乙腈至 50％乙腈的梯度，如果样品不保留，使用 95/3/2的乙腈/甲醇/水相缓冲溶液的流动相进行等度分析。
• 将流动相中的水换成甲醇、丙酮或异丙醇也可以增加极性化合物的保留。
• 请确保洗针溶剂/冲洗溶剂包含和流动相一样的高比例有机相，否则峰形会受到影响。

• 用 50/50 的乙腈/水清洗以去除极性污染物。如果清洗无效，可用 5:95 的乙腈/水清洗 。
• 如果系统压力上升至超过设定的压力限或者突然出现色谱峰分叉，通常是需要更换保护柱的信号。