内切酶实验常见问题大盘点

赵桂芝 0 2021-12-02

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DNA是真核生物的遗传物质,由脱氧核苷酸组成。它是双链互补螺旋结构,定向酶切技术就是用限制性内切酶去切割DNA片断,由于酶具有专一性,一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列,所以可以用特定的这种酶去切割相应的DNA片段,进而达到定向切割的目的。做酶切实验你遇到过这些问题吗?

很少或没有转化子

可能原因:内切酶没有切割完全

解决办法:查看该酶的甲基化敏感性,确定是否由于识别位点的甲基化阻断了酶切反应。使用随酶提供的缓冲液。纯化 DNA 以去除可能抑制酶活的污染物。当酶切 PCR 段时,确保在识别位点和 DNA分子的末端之间至少存在 6 个核苷酸。

酶切后DNA琼脂糖凝胶电泳呈弥散状

可能原因1:内切酶与底物 DNA结合;

解决方法:降低酶的使用量。在上样缓冲液中加入 SDS(0.1-0.5% )以分离与 DNA 结合的酶。

可能原因2:核酸酶污染

解决方法:使用新配制的无杂质的电泳液和新配制的琼脂糖凝胶。纯化 DNA。

酶切不完全

可能原因1:甲基化阻断酶切

解决方法:从细菌分离的 DNA 可能被 Dam 和 Dcm 甲基化阻断。从真核生物分离的 DNA 可能被 CpG 甲基化阻断。查看该酶的甲基化敏感性,确定是否由于识别位点的甲基化阻断了酶切反应。

可能原因2:盐的抑制

解决方法:在含有盐的缓冲液中活性低的酶,可能是对盐敏感,故在酶切前先纯化DNA。使用离心柱纯化的 DNA 可能会造成高盐离子水平,从而抑制酶活性。要避免影响酶活,DNA 溶液体积不应超过总反应体积的 25%。

可能原因3:PCR 组份的抑制

解决方法:在进行酶切前先纯化 PCR 片段。

可能原因4:使用的酶量过少

解决方法:每 µg 的 DNA 至少使用 3-5 单位的酶。

可能原因5:消化超螺旋 DNA

解决方法:某些酶对于超螺旋 DNA 活性较低需在反应中增加酶量。

可能原因6:DNA 被抑制剂污染

解决方法:在底物 DNA 中加入对照 DNA 来检测。如果抑制剂存在,对照 DNA 也无法切割。小量制备的 DNA 尤其容易被污染。用离心柱、树脂或透析纯化 DNA,或者增大反应体系以稀释污染物。

胶中出现多余条带

可能原因1:如果胶中出现比预期更大的条带,可能是由于酶与底物结合

解决方法:降低反应中的酶量。在上样缓冲液中加入 SDS(0.1-0.5% )以分离与底物结合的酶。

可能原因2:星号活性

解决方法:使用随酶提供的推荐缓冲液。降低反应中酶量。确保酶量不超过反应总体积的 10%。这样确保甘油总浓度不超过5% v/v。减少温育时间。使用完全酶切所需的最短反应时间,以避免星号活性。

可能原因3:酶切不完全

解决方法:在含有盐的缓冲液中活性低的酶可能是对盐敏感,故在酶切前先纯化 DNA。使用离心柱纯化的 DNA 可能会造成高盐离子水平,从而抑制酶活性。要避免影响酶活,DNA 溶液体积不应超过总反应体积的 25%,在进行酶切前先纯化 PCR 片段。使用随酶提供的推荐缓冲液。每 µg 的 DNA 至少使用 3-5 单位的酶,并消化 DNA 1-2 小时。

责任编辑：展源

审　　核：何发

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