活性氧 (Reactive oxygen species，ROS) 是一类由细胞有氧代谢产生的具有化学反应活性的一类含氧分子，参与细胞信号转导、免疫防御以及维持体内动态平衡等各项生理活动。然而当细胞处于环境压力时，胞内的ROS 含量水平就会急剧上升造成核酸、蛋白和脂类物质的氧化损伤[1]， 从而引起许多生理、病理变化，诸如男性不育、癌症的发生等等[2]。

　　胞内 ROS 含量水平通常采用荧光探针，尤其绿色荧光探针来检测。然而由于绿色荧光检测和成像易受细胞自发荧光的影响[3]， 因此远/近红外染料常被用来检测 ROS 含量从而避免细胞自发荧光的干扰。

　　SpectraMax® iD5 多功能微孔读板机采用超冷型 PMT 和“2X2”光栅光路设计，可有效降低信号背景减少杂散光，为远红外荧光检测提供更宽的动态范围和更高的灵敏度。

　　这里我们展示的是如何利用 SpectraMax iD5 多功能微孔读板机和 2 个荧光检测试剂盒来进行胞内 ROS 含量分析的。在 Spectral Optimization Wizard 帮助下，我们优化了远红外分析检测下激发光和发射光的不同波长组合，并最终比较了绿色荧光检测 和远红外荧光检测结果的表现

　　优势

　　• 一步均相荧光法可快速检测胞内活性氧

　　• 超冷型 PMT 可进一步降低背景噪声并增强实验表现

　　• Spectral Optimization Wizard 可优化激发和发射光波长

　　材料

　　• Cell Meter™ 荧光胞内总 ROS 活性检测试剂盒 *深红色荧光* (AAT Bioquest cat. #22903)

　　• Cell Meter™ 荧光胞内总 ROS 活性检测试剂盒 *绿色荧光* (AAT Bioquest cat. #22900)

　　• HEK293 细胞 (AATC cat. #CRL-1573)

　　• 甲萘醌 (Sigma cat. #M9429-25G)

　　• 96 孔组织培养板，黑边底透 (Greiner cat. #655087)

　　• SpectraMax iD5 多功能微孔读板机 (Molecular Devices cat. #iD5)

　　方法

　　HEK 293 细胞铺板于 96 孔细胞培养板中， 每孔 1 万个细胞，37 ℃ 培养 24 小时。随后细胞经甲萘醌浓度梯度处理 1 个小时， 甲萘醌起始浓度为 25 μM，倍比稀释系数为 2。最后细胞经 Cell Meter 深红色荧光 ROS 检测试剂或 Cell Meter 绿色荧光 ROS 检测试剂处理，37 ℃ 培养 30 分钟。

　　由于 Cell Meter 深红色荧光 ROS 检测试剂 盒所推荐的激发光和发射光波长相距太近 (658/675 nm)，与 SpectraMax iD5 多功能微孔读板机不太兼容，因此本实验激发 /发射采用预估的 625/700 nm，以便激发 /发射带宽有足够距离且产生足够的荧光信号 ( 图 1 )。

　　SoftMax® Pro 软件的 Spectral Optimization Wizard 能够为远红外分析自动计算出更合适的激发/发射波长，Read Height Optimization 设置能够找出更合适的的读板高度。实验所用的波长和 PMT 增益设置如表 1 所示，数据和图片均采用 SoftMax® Pro 软件产生。

　　结果

　　甲萘醌通过阻断线粒体电子传递链的不同部分使得胞内 ROS 含量积聚[4]，因此当其浓度增加时胞内的 ROS 含量也会相应增加。Cell Meter 深红色荧光 ROS 检测试剂盒和绿色荧光 ROS 检测试剂盒都能够得出甲萘醌剂量反应曲线 并且有相似的 EC50 ( 图 2、3 )远红外分析所用的激发/发射波长经 Spectral Optimization Wizard 优化，可获得本次实验中最优的 Z 因 子 ( 表 2 )。

　　结论

　　对于胞内荧光检测 ROS 含量实验来说， 使用 SpectraMax iD5 多功能微孔读板机结合 SoftMax® Pro 分析软件是一个非常有力的手段。软件中的 Spectral Optimization Wizard 和 Read Height Optimization 能自动优化实验条件以获得更好的实验结果。尽管 SpectraMax iD5 能够有效对胞内 ROS 含量进行绿色荧光检测和远红外荧光检测，然而后者结合激发/发射波长优化设置表现出较前者更为优异的 Z 因子。

　　References

　　1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. "Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways." Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2): 345-50.

　　2. Ogawa K, Suzuki K, Okutsu M, Yamazaki K, Shinkai S. The association of elevated reactive oxygen species levels from neutrophils with low-grade inflammation in the elderly. Immunity & Ageing: I & A. 2008; 5:13. doi:10.1186/ 1742-4933-5-13.

　　3. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene." Nature Methods 8.9 (2011): 726.

　　4. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinskiĭ. "Interaction of menadione and duroquinone with Q-cycle during DTdiaphorase function." Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991):1779 -1786.