2008年，三聚氰胺事件爆发，国家质检总局、卫生部等有关部门展开对乳制品全面清查，发现有多种婴幼儿奶粉、液态奶、酸奶含有三聚氰胺。随后，糖果、巧克力、咖啡奶精等涉乳食品行业也受到波及，食品行业发生重大的食品安全连锁反应。如何防止“三聚氰胺”卷土重来，我们共同关注着........

同时测定婴儿配方奶粉、成人营养品和蛋白粉中三聚氰胺和三聚氰酸的快速、灵敏的方法

摘要

由于婴儿配方奶粉生产商需要检测每批原料和成品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸，因此有必要提供一种快速分析方法。本文所述的基于ACQUITY UPLC/MS/MS的方法由一家大型婴儿配方奶粉生产商的 开发;经证实，该方法非常灵敏且极其耐用，每天能分析100多个样本。

引言

近期牛奶和乳制品中含三聚氰胺事件已经导致中国数以千计的儿童患病，有部分患儿死亡。三聚氰胺(1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺;CAS# 108-78-1)常用于塑料、粘合剂、涂料和阻燃剂的生产。三聚氰酸(1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮;CAS# 108-80-5)是三聚氰胺的一种结构类似物，多作为三聚氰胺的杂质而被发现。这些化合物的化学结构如图1所示。

 

三聚氰胺因其高含氮量而在中国某些地区被用以提高牛奶的表观蛋白含量。人们认为，这两种化合物相结合可引起肾毒性。迄今为止，很多监管机构已经提议将其在婴儿配方奶粉和成人食品中的限量分别定为1.0 ppm(μg/g)和2.5 ppm(μg/g)。美国FDA最近提议1.0 ppm可作为婴儿配方奶粉成品中三聚氰胺或三聚氰酸的容许量，但规定这两种化合物不能同时存在。其他监管机构(如台湾)将三聚氰胺的限量降低至0.05 ppm。用于检测面粉1和宠物食品2中的三聚氰胺和三聚氰酸的方法已经进行过介绍，Shia和Diehl描述了使用特殊的SPE对婴儿配方奶粉3中三聚氰胺和三聚氰酸进行萃取。然而，为确保婴儿配方奶粉的安全性并尽可能及时满足监管机构的检测要求，我们开发了一种用于同步测定三聚氰胺(MEL)和三聚氰酸(CYA)的高灵敏、更快速的新型检测方法，以实现高通量的产品筛查。该方法也适用于分析原料(如酪蛋白或乳清蛋白分离物)，从而在用于婴儿配方奶粉生产前先对其进行核实。同位素内标用于校正样品制备过程中出现的微小偏差，并校正仪器对目标化合物响应中存在的基质效应。

试验

三聚氰胺和三聚氰酸的储备液分别溶解于100mL水中而配制出浓度为100μg/mL的溶液。混合标准溶液通过用流动相B将三聚氰胺和三聚氰酸储备液分别稀释为 2.5μg/mL和5.0μg/mL而制得。混合标准溶液每天现用现配。

三聚氰胺(13C3-15N3-三聚氰胺)和三聚氰酸(13C3-15N3-三聚氰酸)的同位素内标以0.1mg/mL水溶液的形式从剑桥同位素 购得。分析当天，稳定的同位素混合标准溶液通过将同位素内标溶液、标准溶液及2%的甲酸乙腈溶液按1:1:2的比例进行混合而制得

制备程序

■ 对于原料，称量1.0g样品放入一个20mL的玻璃瓶中

■ 添加10.0g水并混匀，使样品溶解-将溶解后的样品用

作营养品样品

■ 称取1.0g产品(粉末或液体)或制备好的原料放入一

个20mL的玻璃瓶中。

■ 加入等量的混合内标溶液

■ 加入5mL的甲酸水溶液(体积比2%)

■ 通过涡旋混合15秒左右或混合至所有固体均已溶解

为止

■ 在第二个20mL的玻璃瓶中放入9mL含10mM醋酸铵的体

积比为97/3的乙腈/水溶液

■ 将1 mL制备好的样品溶液转移至上述第二个玻璃瓶。

■ 混匀

■ 通过一个0.2μm的PTFE滤膜过滤样品并将滤液收集到进

样瓶中

UPLC条件

液相色谱系统： 沃特世ACQUITY UPLC®

： ACQUITY UPLC BEH HILIC

2.1 x 150，1.7μm

流动相： A：10 mM醋酸铵水溶液

B：溶于97/3乙腈/水的10 mM醋酸铵

弱洗针液： 甲醇

强洗针液： 水

进样针类型： PEEK

定量环： 10μL

进样类型： 满环进样

 

质谱条件

质谱系统： 沃特世ACQUITY® TQD

软件： 沃特世MassLynxTM 4.1

三聚氰胺

离子化模式： ESI+

毛细管电压： 3.50 kV

三聚氰酸

离子化模式： ESI-

毛细管电压： 3.00 kV

源温度： 150℃

脱溶剂气温度： 400℃

锥孔气流速： 50 L/小时

脱溶剂气流速： 900 L/小时

碰撞气流速： 0.15 mL/分钟

包括同位素内标在内，每个化合物有2个离子通道。第二个通道用于确认，峰面积的比例必须与实际标准品的相匹配才能被认定结果呈阳性。

 

结果和讨论

三聚氰胺和三聚氰酸的校准曲线通过目标化合物和同位素内标的响应比相对于目标化合物浓度而生成。三聚氰胺(0.25 - 40.0ng/mL)和三聚氰酸(0.50 -80.0ng/mL)的校准曲线均呈线性，仪器得到的相关系数(R2)均大于0.99。三聚氰胺和三聚氰酸的校准残差均低于10%。典型的校准曲线和残差图如图2所示

 

该方法的精准性是通过在方法定量限浓度上对代表性样品和配料加标进行评估。成品加标量为0.083μg/g三聚氰胺和0.568μg/g三聚氰酸。原料加标量为0.416μg/g三聚氰胺和1.26μg/g三聚氰酸。三聚氰胺和三聚氰酸的回收率均介于90 - 110%之间，四天内由多位分析员用两台仪器得出的八次独立测定结果的相对标准偏差的平均值几乎都< 10%。结果汇总于表1。

 

方法检出限(MDL)和方法定量限(MQL)根据40CFR第136部分附录B所述的方法进行确定。检出限根据所测定浓度的标准差计算得出，定量限被定义为检出限的三倍。在8天内用两台仪器分别对加标样品进行分析后，三聚氰胺和三聚氰酸的方法定量限分别被确定为0.039μg/g和0.105μg/g。由于原料分析需要进行稀释，因此检出限大约高出10倍。

串联质谱可在选择反应监测(或多反应监测)模式下进行选择性检测。在这种运行模式下，仅可检出特定母离子/子离子对的化合物。如图3所示，三聚氰胺的产物离子光谱包含两个子离子。

在三聚氰胺分析中同时监测两个MS/MS通道而使得方法专一性增强。如果在127→85和127→68 MRM色谱图中存在相同色谱峰，并且该峰的响应比必须在所得到的标准品响应比的20%以内，那么可以鉴定出三聚氰胺阳性的结果。标准品(0.25ng/mL三聚氰胺和2.0ng/mL三聚氰酸)、一种非强化型婴儿配方奶粉和一种强化型婴儿配方奶粉(0.083μg/g三聚氰胺和 0.568μg/g三聚氰酸)的典

型色谱图如图4所示。

 

使用同位素内标可大大增强该方法的定量能力和耐用性。通过这种简单稀释和进样程序，每天仅使用ACQUITY TQD即可对100多份样品是否存在三聚氰胺和三聚氰酸进行检测。经证实，该方法适合分析95%以上的婴儿配方奶粉、营养品和蛋白粉样品。在其他情况下，或者对有共流出干扰的复杂基质，应采用一个包括阳离子或阴离子交换SPE的固相萃取(SPE)步骤。

结论

现已开发出一种用于同时测定液体和粉末状婴儿配方奶以及成人营养品中三聚氰胺和三聚氰酸的快速而耐用的方法，并根据40 CFR第136部分进行了验证。成品中三聚氰胺的检出限和定量限分别为0.013μg/g和0.039μg/g，三聚氰酸相应为0.035μg/g和 0.105μg/g。对于加标样品(n=48、8天、两台仪器)而言，三聚氰胺(0.083μg/g)的平均回收率和精确度为100.9%，相对标准差 6.8%;三聚氰酸(0.568μg/g)为99.1%，相对标准差10.4%。

简单稀释后，配备TQ检测器的ACQUITY UPLC系统可同时对三聚氰胺和三聚氰酸进行快速分析(不到6分钟)。UPLC®与串联质谱检测相结合提供了卓越的灵敏度和每天分析超过100份样品的高通量。同位素内标的加入在较宽的浓度范围内和各种产品类型中提供了良好的线性和定量效果，从而使三聚氰胺和三聚氰酸的鉴定和定量结果可信。

所述方法具有快速筛查包括婴儿配方奶粉的蛋白原料、奶源和营养品的能力，从而可确保生产商和监管机构能保证产品的安全性和完整性。